浓香型大曲白酒窖泥微生物研究进展分离和鉴定新型窖泥微生物-潮创云廊

1 窖泥的浓香泥微概述

浓香型白酒是一类以泥窖固态发酵生产的白酒，泥窖尤其是曲白人工泥窖大多采用黄黏土筑窖。白酒工作者对浓香型白酒生产实践经验的酒窖进展高度凝练和总结———千年窖池万年糟，窖池越老酒越香。生物在一定范围内窖泥的研究质量与浓香型大曲酒的质量存在一定关系，即窖泥越老，浓香泥微大曲酒的曲白质量越高。窖泥中的酒窖进展主要功能微生物是在长期的发酵过程中筛选出来的，它们的生物群落结构对浓香型白酒的香味有较大的影响。窖泥微生物之间存在共生、研究互生及竞争等多种种群关系，浓香泥微长期的曲白白酒生产使窖泥微生物的种类逐渐稳定，同时产香味物质的酒窖进展功能微生物数量也呈上升趋势。目前研究发现新窖泥以乳杆菌为主，生物而老窖泥以梭菌纲、研究拟杆菌纲和产甲烷菌纲为主

2 窖泥微生物的研究技术

以往关于窖泥微生物的研究多基于纯培养的方式，从可培养的角度研究微生物群落和动态变化，分离和鉴定新型窖泥微生物，为浓香型白酒功能菌的筛选及菌种库的建立提供依据。随着微生物生态学的发展，分子生物学等先进技术越来越多地应用于窖泥微生物鉴定、群落组成解析等研究，使得对窖泥微生物认识越来越深入。

2.1 传统窖泥微生物研究技术

传统窖泥微生物研究方法是平板分离纯化及鉴定技术，该鉴定技术包括传统的菌落形态、生理生化以及对核酸序列对微生物分类。然而窖泥中能够采用平板分离培养的微生物仅占窖泥微生物的一部分。目前运用传统平板仅能分离得到可培养的微生物，对窖泥微生物的深入研究的意义不大。已证明表现型相同的微生物可能是一群有相同的生理特征或形态特征的微生物，这样是不足以明确分类的。虽然传统窖泥微生物研究技术对窖泥微生物的研究存在不足，但厌氧培养、纯培养技术和传统的微生物鉴定技术为白酒生产起到了重要的推动作用。从浓香型窖泥中分离纯化得到5株细菌，并用传统微生物鉴定系统鉴定了其中一株细菌。应用传统微生物分离方法从浓香型窖泥中分离研究了窖泥微生物的生理特性。通过对泸州老窖酒厂不同窖龄窖泥中5大功能菌群的数量和生态结构研究，发现窖泥功能微生物的数量随窖龄增加而增加。以纯培养方法对窖泥中的微生物研究由来已久。传统纯培养技术在窖泥研究中仍被广泛使用，这主要是由于该技术可以研究特定微生物的理化特征，分离得到的功能微生物可应用于白酒生产。

2.2 现代窖泥微生物研究技术

随着微生物研究技术的发展，分子生物学技术越来越多地应用于窖泥微生物鉴定、群落组成解析等研究。现代分子生物技术具有不需培养、快速准确、灵敏度高等特点，对窖泥微生物的研究更加深入，现代分子生物技术可将窖泥微生物在种属水平上进行系统分析，对泥的实际生产和养护不仅可以提供理论指导，还能解决窖泥退化和老化问题。

2.2.1 磷脂脂肪酸指纹图谱技术在窖泥微生物研究中的应用

磷脂是大多数微生物（古生菌除外）细胞膜中相对稳定的成分，且含量相对比较稳定，只有微生物死亡后，磷酯类化合物才会迅速分解。不同种类的微生物细胞膜上的磷脂脂肪酸组成及含量存在显著差异，即特定的特征脂肪酸仅存在特定的微生物中。如：脂肪酸15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用来表征放线菌。磷脂脂肪酸技术不需要酸15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用来表征细菌；脂肪酸16∶0，18∶2ω6等用来表征真菌；不分离培养即可获得微生物群落信息，适合微生物群落的研究。该技术主要是提取脂肪酸结合常见微生物的磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）谱图数据库和利用气相色谱即可完成对微生物的鉴定，操作简便、结果较为可靠，能定量描述环境样品中的微生物群体。近年来，磷脂脂肪酸技术在窖泥微生物的研究中得到广泛应用。PLFA指纹图谱技术分析法可简单归纳为：（1）提取磷脂脂肪酸；（2）气相色谱分析，获得PLFA谱图；（3）通过谱图的变化得到微生物结构变化情况。采用磷脂脂肪酸指纹图谱技术对窖泥微生物进行了研究，结果表明厌氧细菌和真菌是窖泥中的优势菌群。采用磷脂脂肪酸指纹图谱技术研究30年、100年的窖泥发现，100年窖龄的窖泥微生物比30年窖龄的丰富，细菌是窖泥的优势菌群。

2.2.2 克隆文库技术在在窖泥微生物研究中的应用

克隆文库是通过获得窖泥样品总脱氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA），以提取到的总DNA为模板聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增微生物的16S rDNA基因，然后将得到的扩增产物与载体连接，转化感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序，根据测序结果判断样品中的微生物信息，由于克隆文库针对原核微生物的16S rDNA全长，且避开了传统的纯培养方法，能将一些对营养要求苛刻的微生物鉴定出来，因此能更全面的反映样品中的微生物多样性；由于采用该方法能获取微生物的16S rDNA全序列，所以结果也更加准确。以克隆文库技术对不同窖龄窖泥古菌进行研究，研究结果表明，通过16S rDNA克隆文库技术能够系统地认识了不同窖龄窖泥细菌群落的基本构成及演替规律。窖泥微生物在50年前后变化明显，50年之前窖泥中古菌种群结构变化较大；50年之后，古菌群落结构趋于稳定。以克隆文库技术对泸州地区浓香型窖泥原核微生物群落结构进行研究，研究结果表明，梭菌纲为窖泥内细菌群落的绝对优势种群，除此之外还存在一定比例的芽孢杆菌纲、拟杆菌门、柔膜菌门和互养菌门的分布。此外该研究还首次发现在泸州老窖窖泥内可能存在与甲烷菌共生的严格厌氧的梭菌纲类群的存在。尽管通过克隆文库法对窖泥的研究取得了一些成果，但该技术仍有不足，如操作繁
琐，且耗时耗力等。

2.2.3 PCR-DGGE技术在窖泥微生物研究中的应用

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术最初用于检测DNA中的点突变，后来逐渐用于环境微生物多样性的分析，如活性污泥、海洋、土壤等方面的微生物群落研究]。温度、pH等外界因素可以使DNA分子由双链变性为单链。聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术原理是利用不同DNA分子解链难易程度以及在聚丙烯酰胺电泳中迁移受分子质量和电荷的影响程度不同而实现分离。该技术无需培养、直接提取总DNA分析的微生物多样性具有简便快速、结果准确，在白酒微生物的研究中起着重要作用。采用PCRDGGE技术及测序技术研究了不同窖泥细菌群落结构及多样性变化趋势，结果发现窖龄越长，细菌群落结构越稳定。通过PCR-DGGE技术研究了不同窖龄窖泥中主要微生物群落结构与窖泥理化指标之间的关系。

研究结果表明窖泥的理化指标和微生物群落结构变化有极大相关性。应用PCR-DGGE技术分析了不同性状窖泥的细菌群落，结果表明，窖泥中优势微生物包含拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和厚壁菌门4个门类，其中新窖泥中微生物最丰富，涵盖上述门类，假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌（Enterobacterale），里氏杆菌属（Riemerella）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）为新窖泥特有的优势微生物。虽然PCR- DGGE具有免培养，检测快速、准确等优势，是白酒窖泥微生物群落结构的主要研究方法之一，但对一些数量低的窖泥微生物不能有效地检测出。由于PCR-DGGE技术的优势明显，在白酒窖泥微生物群落的研究中有着重要影响，随着技术的发展，PCR-DGGE技术会不断优化，与其他现代生物技术结合，揭示窖泥微生物的“秘密”。

3 结论与展望

在浓香型大曲白酒固态发酵过程中逐渐形成了复杂的窖泥微生物群落，微生物菌群相互作用和独特的生产工艺形成了浓香型大曲白酒窖香浓郁、绵甜爽烈的风格特征。由于窖泥中的酿酒微生物群落结构的复杂性，以及部分微生物难于分离培养，使得对窖泥微生物的研究提出了更高的要求。近年来，随着现代分子生物技术在窖泥中的应用，对窖泥微生物的研究越来越深入。主要集中在窖泥微生物群落多样性和窖泥微生物群落的演替及窖泥微生物群落结构与窖泥质量关系等方面的研究。运用现代化的仪器设备和现代分子生物技术（克隆文库、DGGE、测序技术等）揭开了窖泥微生物的部分面纱：窖泥中的微生物种类与窖泥的质量关系极大，老熟窖泥中的优势微生物有拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和厚壁菌门等4个门类，其中放线菌可以作为一种判断窖泥老熟与老化的指示菌。虽然现代分子生物技术已大量应用于窖泥微生物的研究，但是传统微生物学技术对窖泥微生物的研究仍占有重要的地位。总之，要完全认识窖泥微生物还存在较多技术瓶颈和壁垒。为进一步掌握白酒窖泥微生物与窖泥质量以及在代谢上的关系，宏基因组学、微生物代谢组学等现代分子生物技术将有助于加深对窖泥微生物代谢活动的认识和了解窖泥微生物群落代谢机制，有助于解决白酒生产中遇到的实际问题，以便生产更多优质的浓香型大曲白酒。

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